Marqueurs phénotypiques et génotypiques bactériens


1 - CONSIDERATIONS GENERALES

1-1 NECESSITE DE CRITERES FINS DE CARACTERISATION BACTERIENNE

*· Les bactéries responsables d'infections nosocomiales sont généralement ubiquitaires. L'objectif est de montrer que des souches d'une espèce bactérienne reliées épidémiologiquement ont des caractères communs différents de ceux de souches non reliées.

*· Les examens bactériologiques classiques se limitent généralement à l'identification de l'espèce et à l'étude de la sensibilité aux antibiotiques.

*· D'où l'utilité de marqueurs, stables dans une souche, variables dans une espèce, permettant une différenciation fine.

1-2 CARACTERISTIQUES D'UN SYSTEME IDEAL

Le système idéal doit être :
- standardisé,
- discriminant,
- reproductible et stable dans le temps,
- largement applicable (simple, peu coûteux),
- de valeur prouvée dans l'investigation épidémiologique.
Ces caractéristiques s'appliquent à des degrés variables aux systèmes décrits.

2 - DIVERSITE DES METHODES UTILIABLES POUR LE TYPAGE
DEUX GRANDES CATEGORIES


*· Les méthodes phénotypiques étudiant les propriétés exprimées par les bactéries : résistance aux antibiotiques, biotypie, lysotypie, bactériocinotypie, profils protéiques.

*· Les méthodes génotypiques, s'adressant à l'analyse du génome bactérien : plasmides, chromosome.

3 - METHODES PHENOTYPIQUES

3-1 RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES

*· Généralement premier marqueur utilisé et signe d'appel permettant de repérer le caractère épidémique de souches particulières.

*· Applicable à toutes les souches, quelle que soit la méthode utilisée (diffusion, dilution).

*· Peu coûteux et standardisé.

*· Limites
- peu discriminant pour les espèces très sensibles ou très résistantes naturellement,
- caractère parfois instable de la résistance (support plasmidique, importance de la pression de sélection des antibiotiques),
- appréciation des critères de différenciation parfois difficile.

3-2 BIOTYPIE

3-2-1 Étude des propriétés métaboliques

*· Intérêt des propriétés inhabituelles au sein d'une espèce, ex : Escherichia coli ne produisant pas d'indole.

*· Possibilité d'utiliser des galeries d'identification miniaturisées mais elles sont plus adaptées à l'identification d'une espèce qu'à celle de souches particulières (pouvoir discriminant faible).

*· Autre limite : possibilité de variations phénotypiques pour des souches dérivées d'un seul clone, instabilité d'un caractère.

3-2-2 Pigmentation des colonies

*·Ex: Serratia marcescens pigmentées

3-3 SEROTYPIE

*· Caractérisation des antigènes bactériens : variété des antigènes décelables (capsulaires, somatiques, flagellaires) - intérêt de la détermination combinée de plusieurs variétés d'antigènes pour une même souche
.
*· Techniques utilisables : agglutination, coagglutination, Elisa, immunofluorescence.

*· Applicable en routine à P. aeruginosa, E. coli, Salmonella, N. meningitidis, etc

*· Intérêt de la relation éventuelle sérotype / pouvoir pathogène (E. coli).

3-4 LYSOTYPIE ET BACTERIOCINOTYPIE

3-4-1 Lysotypie

*· Etude de la sensibilité d'une bactérie à la lyse par un panel de bactériophages connus. Liée à la présence de récepteurs pour ces bactériophages situés sur les enveloppes bactériennes.

*· Application à différentes espèces : permet de séparer 5 groupes chez S. aureus, autres applications pour Salmonella, Listeria, P. aeruginosa.

3-4-2 Bactériocinotypie

*· Utilise des bactériocines : protéines codées par des plasmides, produites par des bactéries, létales pour d'autres bactéries de même espèce. Portent des noms variables selon l'espèce qui les produit (ex : colicine pour E. coli, pyocine pour P. aeruginosa).

*· Typage :

- soit en étudiant la sensibilité d'une bactérie à différentes bactériocines connues,
- soit en recherchant la production de bactériocines sur des bactéries tests.

3-4-3 Limites de la lysotypie et de la bactériocinotypie

*· Techniques très lourdes, parfois peu reproductibles, réservées à des centres de référence qui seuls possèdent les réactifs nécessaires.

*· La lysotypie est plus couramment réalisée que la bactériocinotypie qui reste exceptionnelle.

3-5 ETUDE DES PROFILS PROTEIQUES

3-5-1 Protéines totales ou protéines de surface

*· Électrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant (SDS-PAGE) : sépare les protéines en foncion de leur taille.

*· Révélation :
- par coloration au bleu de Coomassie ou au nitrate d'argent : bandes nombreuses, interprétation difficile,

- par immunoblot : après transfert sur membrane, révélation par immun sérum spécifique. Ne révèle que les bandes spécifiques.

*· Permet théoriquement de typer toutes les souches mais technique lourde.

3-5-2 Alloenzymes

*· Détecte différences de mobilité électrophorétique d'enzymes identifiées (ex : estérases), dépendant de leur composition en acides aminés.

*· Électrophorèse en gel non dénaturant.

*· Révélation par le substrat spécifique de l'enzyme.

*· Techniques lourdes.

4 - METHODES GENOTYPIQUES

4-1 CARACTERISTIQUES

4-1-1 Développement important
*· Vulgarisation des techniques de biologie moléculaire.
· Les mêmes techniques, équipements et réactifs sont utilisables pour toutes les bactéries.

4-1-2 Séparation potentielle très fine des souches
*· Variation selon les espèces.
*· Problèmes de critères de définition de souches différentes.

4-2 PROFILS PLASMIDIQUES

*· Comparaison du profil plasmidique de différentes souches.

*· Technique largement utilisable en raison du très grand nombre de bactéries hébergeant des plasmides et de la simplicité relative de la technique (extraction partielle de l'ADN, électrophorèse).

· Limites :
- mobilité des plasmides pouvant être perdus ou acquis
- possibilité de modification génétique des plasmides (transposition),
- faible pouvoir discriminant si les bactéries hébergent seulement 1 ou 2 plasmides.

4-3 PROFIL DE RESTRICTION DE L'ADN CHROMOSOMIQUE

*· Analyse des fragments obtenus après coupure par des enzymes de restriction de l'ADN bactérien total : détermination de leur nombre et de leur taille par électrophorèse conventionnelle en gel d'agarose.

*· Lecture difficile car nombre de bandes très élevé (environ 10 3 ).

*· Perturbation possible par la présence de plasmides.

4-4 DIVERS TYPES d' ÉTUDE DE L'ADN CHROMOSOMIQUE

- APRES HYBRIDATION SELON LA TECHNIQUE DE SOUTHERN

- PAR ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE

- PAR SEQUENçAGE DE L'ADN